iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技術(shù)是生物學領(lǐng)域應用廣泛的兩種蛋白質(zhì)標記定量技術(shù)。iTRAQ/TMT試劑由報告基團、平衡基團和反應基團三個基團構(gòu)成。反應基團與肽段相連接使iTRAQ/TMT試劑結(jié)合在肽段上，在一級譜圖中，不同樣本的同一肽段，標記后表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在二級譜圖中，報告基團、平衡基團和反應基團之間的鍵斷裂，帶不同同位素標簽的同一肽段產(chǎn)生質(zhì)量不同的報告離子，根據(jù)報告離子的豐度可獲得樣本間相同肽段的定量信息。
質(zhì)譜儀
FusionLumos、Q Exactive HF、Oribtrap、Q TOF 6600
技術(shù)優(yōu)勢
定量準確：基于高效的鑒定軟件和嚴格的過濾條件，控制鑒定結(jié)果的可靠性
適用性廣：適用于所有物種的各類樣本
檢測通量高：一次可檢測8個樣本
蛋白數(shù)量多：能鑒定高達10000種蛋白
技術(shù)流程
實驗流程
信息分析
生信分析總流程
標準信息分析
（1）蛋白鑒定
（2）蛋白功能注釋
（3）蛋白亞細胞定位
（4）蛋白定量
（5）差異蛋白篩選
（6）蛋白互作
個性化分析
（1）蛋白組+轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
（2）其余個性化分析
分析結(jié)果示例
案例分析
案例（1）腫瘤內(nèi)皮細胞來源的cadherin-2促進血管生成，對肺腺癌有預后意義
本研究選取腺肺癌臨床組織分離的TECA（癌組織分離血管內(nèi)皮細胞）、PECA（癌旁組織分離血管內(nèi)皮細胞）及NECA（正常組織分離血管內(nèi)皮細胞）進行iTRAQ蛋白組學分析和實驗驗證，發(fā)現(xiàn)血管蛋白Cadherin-2（CDH2）在肺癌組織和細胞中顯著上調(diào)。通過結(jié)合過表達實驗和臨床樣本評估結(jié)果，確認CDH2降解及表達的異質(zhì)性導致了與癌細胞粘附和細胞遷移/增殖相關(guān)的不同調(diào)控行為。研究為證實cadherin-2作為腺肺癌臨床診斷新的分子靶標提供理論基礎(chǔ)。
圖1 差異蛋白表達熱圖和不同樣本組蛋白數(shù)據(jù)的PCA分析
案例（2）WDR74通過RPL5-MDM2-p53通路調(diào)節(jié)黑素瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移
本研究對小鼠黑色素瘤細胞株和黑色素瘤轉(zhuǎn)移細胞株進行iTRAQ蛋白組學分析和qPCR、免疫印跡等實驗，發(fā)現(xiàn)并驗證了WDR74能促進細胞周期的進展和細胞增殖，并通過過表達和敲除實驗等揭示了WDR74對RPL5-MDM2-p53通路的調(diào)控作用。WDR74及其機制的研究為WDR74作為臨床預防和治療黑素瘤的候選靶點提供理論依據(jù)。
圖2 通過iTRAQ檢測到WDR74的電離肽的注釋質(zhì)譜
圖3 WDR74調(diào)控RPL5-MDM2-p53通路機制圖
案例（3）利用串聯(lián)質(zhì)譜標簽(TMT)標記揭示小鼠附睪脂肪組織中年齡和高脂飲食特異性蛋白質(zhì)組的變化
本研究主要從不同年齡的高脂與低脂小鼠中分離附睪脂肪組織，采用TMT標記法探索年齡和高脂飲食對附睪組織中蛋白質(zhì)的變化。揭示出長期高脂飲食顯著改變了55種與免疫應答和腎素-血管緊張素系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，確定了與年齡相關(guān)和高脂肪飲食特異性蛋白質(zhì)組學特征，突出了精氨酸代謝對年齡增長的響應，以及支鏈氨基酸代謝對高脂肪喂養(yǎng)的早期響應。
圖4 附睪脂肪蛋白質(zhì)組中飲食和年齡相關(guān)變化比較的實驗設(shè)置和工作流程
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