T淋巴細(xì)胞（T cell）和B淋巴細(xì)胞（B cell）主要負(fù)責(zé)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，其抗原識別主要依賴于T細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR）和B細(xì)胞受體（B cell receptor, BCR），這兩類細(xì)胞表面分子的共同特點(diǎn)是其多樣性，可以識別多種多樣的抗原分子。BCR的重鏈和TCR β鏈由V、D、J、C四個基因片段組成，BCR IGL鏈和TCR α鏈由V、J、C三個基因片段組成，這些基因片段在遺傳過程中發(fā)生重組、重排，組合成不同的形式，保證了受體多樣性。
傳統(tǒng)免疫組庫研究方式局限性較大，10x Genomics新推出的“單細(xì)胞免疫譜分析”利用其微流控芯片制備單細(xì)胞體系，選擇5’ 端接頭的通用引物和免疫分子恒定區(qū)的巢式引物進(jìn)行V(D)J富集，實現(xiàn)在單細(xì)胞水平，對成對的重鏈和輕鏈（B細(xì)胞）或α和β鏈（T細(xì)胞）進(jìn)行全長測序，為免疫組庫全面、系統(tǒng)的研究提供了高效的技術(shù)平臺，對疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制研究有重要的意義。
圖1. 10x Genomics單細(xì)胞系統(tǒng)
1 技術(shù)原理
10x Genomics單細(xì)胞免疫組庫測序是建立在GemCode技術(shù)上的微流體平臺，將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個細(xì)胞包裹在油滴中；接下來在每個油滴內(nèi)，凝膠珠溶解，細(xì)胞裂解釋放mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生用于測序帶條形碼的cDNA。液體油層破壞后，cDNA一分為二，后續(xù)同時進(jìn)行基因表達(dá)和免疫組庫文庫構(gòu)建；其中TCR或者BCR的V(D)J序列通過設(shè)計在TCR或者BCR的C區(qū)域的巢式PCR引物進(jìn)行富集。然后使用Illumina測序平臺對文庫進(jìn)行測序檢測，即可一次性獲得大量單細(xì)胞的基因表達(dá)和免疫組庫數(shù)據(jù)，實現(xiàn)在單細(xì)胞水平同時對基因表達(dá)和免疫組庫的研究。
圖2. BCR測序技術(shù)流程[1]
2 樣本要求
◆ 樣品類型：新鮮人或小鼠細(xì)胞懸液、血液（全血、PBMC等）；
◆ 細(xì)胞來源：血液提取、磁珠富集、流式分選、組織解離；
◆ 細(xì)胞大小：小于40μm；
◆ 細(xì)胞總量：細(xì)胞懸液，一個樣本細(xì)胞起始量約1x105個；
◆ 質(zhì)量要求：細(xì)胞活性大于85%，理想濃度為1000個/μl（500~2000個/μl）；
◆ 細(xì)胞培養(yǎng)基及緩沖液不能含有Ca2+和Mg2+等影響酶活性的物質(zhì)。
3 實驗流程
利用10x Genomics平臺完成單細(xì)胞的分離、反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，選擇不同的研究目的進(jìn)行文庫構(gòu)建：5’ 基因表達(dá)文庫、TCR的V(D)J文庫或和BCR的V(D)J文庫。將cDNA分成2份或3份同時進(jìn)行TCR/BCR的V(D)J富集、文庫構(gòu)建、測序和5’ 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建、測序，獲得每個細(xì)胞表達(dá)譜和V(D)J全長序列，獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞亞群聚類、細(xì)胞表達(dá)特征和標(biāo)記分子篩選等分析。
圖3. 實驗流程
表1. 5’ 單細(xì)胞表達(dá)譜和V(D)J免疫組文庫及測序參數(shù)
4 分析內(nèi)容
測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制；
比對與注釋：樣本基本信息結(jié)果統(tǒng)計，樣本contig注釋信息結(jié)果統(tǒng)計，樣本Consensus序列注釋信息結(jié)果統(tǒng)計；
Clonotype分型；
特征分析：CDR3特征分析，V/J基因特征分析，V-J Paired特征分析；
多樣本分析：樣本間Clonotype比較，Overlapping Clonotype聚類分析，Overlapping Clonotype差異分析。
5結(jié)果展示
圖4. 組 Case VGene 核酸長度分布圖 圖5. 組 Case VGene 氨基酸長度分布圖
（左圖橫坐標(biāo)為VGENE堿基序列長度，右圖橫坐標(biāo)為VGENE氨基酸序列長度，縱坐標(biāo)為clonotype的頻率，不同顏色表示不同clonotype，彩色表示top10 clonotype，灰色表示除top 10以外的其他clonotype。）
圖6. 樣品 TCR_Sample_1 鏈TRA_TRB V-J paired頻率Circos圖
（V-J paire頻率Circos圖，最外圈弧形表示V、J基因，每個顏色塊代表一種基因，基因頻率越高，色塊越寬；內(nèi)部色塊間連接弧線表示V-J paired。）
5 技術(shù)優(yōu)勢
可實現(xiàn)配對的重鏈和輕鏈（B細(xì)胞）或α和β鏈（T細(xì)胞）的全長測序；
精確到單細(xì)胞水平，能獲得大量單細(xì)胞的免疫組數(shù)據(jù)；
大規(guī)模單細(xì)胞VDJ表達(dá)譜測序，單個細(xì)胞成本大大降低；
同時獲得5’ gene expression的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可與免疫組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析
6 案例分享
Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment
發(fā)文期刊：Cell
影響因子： 30.41
了解腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的表型，對于癌癥進(jìn)展和免疫治療反應(yīng)的研究至關(guān)重要。研究者使用單細(xì)胞RNA測序分析了來自8位原發(fā)性乳腺癌患者的45,000個免疫細(xì)胞，同時也添加了正常乳腺組織、血液和淋巴結(jié)中的免疫細(xì)胞作對照。研究者開發(fā)了預(yù)處理流程SeQC和貝葉斯聚類和歸一化方法Biscuit，用來解決單細(xì)胞數(shù)據(jù)固有的計算難題。研究中觀察到正常免疫細(xì)胞與腫瘤組織中免疫細(xì)胞之間有顯著相似性，但后者針對腫瘤微環(huán)境出現(xiàn)特異性連續(xù)表型擴(kuò)展。對來自另外27,000個T細(xì)胞的成對單細(xì)胞RNA和T細(xì)胞受體（TCR）測序，結(jié)果揭示了TCR組合使用對表型多樣性的影響。研究結(jié)果支持T細(xì)胞連續(xù)活化模型，但不符合癌癥中的巨噬細(xì)胞極化模型[2]。本研究結(jié)果對表征腫瘤浸潤免疫細(xì)胞具有重要意義。
圖7 分析路程圖
參考文獻(xiàn)：
1. Yaari, G. and S.H. Kleinstein, Practical guidelines for B-cell receptor repertoire sequencing analysis. Genome medicine, 2015. 7(1): p. 1-14.
2. Azizi, E., et al., Single-cell map of diverse immune phenotypes in the breast tumor microenvironment. Cell, 2018. 174(5): p. 1293-1308. e36.
