外顯子組測序是指利用高效的序列捕獲技術(shù)將基因組中的外顯子區(qū)域捕獲后進(jìn)行高通量測序的方法。在人類基因中大約有180,000個外顯子，雖然外顯子組僅占人類基因組的1%（約30MB），但是約85%的致病突變發(fā)生在外顯子組區(qū)域。外顯子組測序主要用于識別和研究與疾病、種群進(jìn)化相關(guān)的編碼區(qū)及UTR區(qū)域內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異。結(jié)合大量的公共數(shù)據(jù)庫提供的外顯子數(shù)據(jù)，能夠更好地解釋所得變異結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)和致病機(jī)理。相比傳統(tǒng)方法，外顯子組測序能夠更經(jīng)濟(jì)高效的檢測外顯子區(qū)域的變異情況，以此來為臨床診斷和個體化用藥服務(wù)。外顯子組測序目前已被廣泛的應(yīng)用于各種癌癥、單基因病、復(fù)雜疾病和罕見遺傳病等研究中。
1、實(shí)驗(yàn)方案
捕獲平臺：Agilent SureSelect Human All Exon V6（最新捕獲試劑盒）
測序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000 PE150
數(shù)據(jù)量：推薦100×以上的深度測序，約10G clean data
2、技術(shù)優(yōu)勢
（1）高覆蓋度：同等費(fèi)用下獲得更高深度測序，SNP檢出率99%；
（2）更高通量：適合大樣本量的研究；
（3）經(jīng)濟(jì)高效：相比于全基因組重測序，更加經(jīng)濟(jì)、高效；
（4）周期短：加快文章發(fā)表與加速臨床應(yīng)用。
3、數(shù)據(jù)分析
3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及數(shù)據(jù)質(zhì)量評估；
（2）與參考序列進(jìn)行比對、統(tǒng)計測序深度及覆蓋度；
（3）SNP和InDel變異信息檢測；
（4）SNP和InDel變異所在基因的功能注釋（GO、Pathway）；
（5）CNV檢測和注釋分析；
（6）變異基因保守性預(yù)測及致病性分析（SIFT、Polyphen-2、GERP）；
3.2 高級信息分析
（1）癌基因/抑癌基因/易感基因篩查；
（2）高頻突變基因統(tǒng)計及通路富集分析；
（3）NMF突變特征及突變頻率分析；
（4）已知驅(qū)動基因篩選；
（5）基因組變異Circos圖展示。
4、捕獲平臺介紹
Agilent SureSelect Human All Exon V5 特點(diǎn)如下：
（1） 捕獲范圍為50Mb，包括21,522條基因的357,999個外顯子區(qū)域；
（2） 根據(jù)CCDS、RefSeq、GENECODE、miRNABase、TCGA及UCSC數(shù)據(jù)庫設(shè)計探針，可有效獲得外顯子區(qū)及其周邊區(qū)域的變異信息。
（3）周期短，僅需1.5天，測序樣品便可準(zhǔn)備就緒。
5、技術(shù)流程
6、案例分析
案例（1）外顯子組測序揭示結(jié)直腸癌耐藥新機(jī)制
該研究通過對129個結(jié)直腸癌小鼠進(jìn)行外顯子測序以及拷貝數(shù)變異分析，對55個人類腫瘤樣本進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域測序，鑒別出了晚期大腸癌中與耐藥和藥物敏感性相關(guān)的6個基因的新突變， ERBB2，EGFR，F(xiàn)GFR1，PDGFRA，MAP2K1和IRS2，并揭示出了對西妥昔單治療抗產(chǎn)生耐藥的新機(jī)制。這項(xiàng)研究證實(shí)替身可為在人類癌癥中評估靶向療法及將這些反應(yīng)與潛在基因組學(xué)關(guān)聯(lián)起來提供一種系統(tǒng)的途徑。在替身中取得成功的療法或許可以指導(dǎo)個體患者的新療法及幫助藥物開發(fā)。
圖1 不同體細(xì)胞突變對西妥昔單抗治療腫瘤的增長的影響
案例（2）遺傳及化學(xué)誘導(dǎo)的KRAS驅(qū)動的肺癌基因突變?nèi)皥D
對非小細(xì)胞肺癌模型的小鼠進(jìn)行外顯子測序。KrasLA2誘發(fā)的肺癌比致癌物質(zhì)誘發(fā)的肺癌有顯著水平的非整倍體以及拷貝數(shù)變異（CNV），這表明化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的腫瘤與轉(zhuǎn)基因模型擁有不一樣的腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。
圖1遺傳和化學(xué)誘導(dǎo)肺癌樣本的拷貝數(shù)情況
圖2 發(fā)生在致癌物誘導(dǎo)腫瘤中的驅(qū)動SNV
案例（3）外顯子組測序發(fā)現(xiàn)皮膚基底細(xì)胞癌的新的驅(qū)動基因和發(fā)展路經(jīng)
皮膚基底細(xì)胞癌（BCC）是最常見的一種癌癥，90%的人都存在發(fā)病風(fēng)險，尤其是年齡大和紫外線照射多的人。研究人員測序了236名患者的293個皮膚基底細(xì)胞癌（BCC）的腫瘤樣本，并將測序結(jié)果與患者健康細(xì)胞的遺傳學(xué)圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了MYCN、PTPN14和LATS1都是BCC的驅(qū)動基因。進(jìn)一步研究表明，這些癌癥驅(qū)動子也存在于Gorlin綜合征中，這可能就是Gorlin綜合征患者更容易患BCC的原因。
圖1 BCC的突變?nèi)皥D
參考文獻(xiàn)
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[2] Westcott et al. The mutational landscapes of genetic and chemical models of Kras-driven lung cancer. Nature, 2015.
[3] Bonilla et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nat Genet, 2016.
