DNA甲基化研究一直是疾病研究的熱點(diǎn),與基因表達(dá)、表型性狀息息相關(guān)。是基因調(diào)控的手段之一,通過(guò)對(duì)位于啟動(dòng)子及基因區(qū)CpG島的甲基化而抑制基因的表達(dá)。在維持細(xì)胞正常功能、傳遞基因組印記,胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等方面起著至關(guān)重要的作用。
RRBS(Reduced Representation Bisulfite Sequencing)是一種準(zhǔn)確且高性價(jià)比的DNA甲基化研究方法,在大規(guī)模臨床樣本的研究中有著廣泛的應(yīng)用。RRBS通過(guò)限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切,富集啟動(dòng)子及CpG島區(qū)域,再進(jìn)行Bisulfite轉(zhuǎn)化, 結(jié)合Illumina高通量平臺(tái)測(cè)序，是一種高性價(jià)比測(cè)序方法。用較小的數(shù)據(jù)量得到包含最多CpG位點(diǎn)甲基化信息的單堿基精度的甲基化圖譜。
應(yīng)用方向
1. 隊(duì)列研究、疾病分子分型、臨床樣本的甲基化 Biomarker 篩選; 復(fù)雜疾病及腫瘤發(fā)病機(jī)制等甲基化研究;
2. 模式動(dòng)物發(fā)育和疾病甲基化研究;
3. 動(dòng)物遺傳育種及進(jìn)化發(fā)育等甲基化研究;
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1. Bisulfite 結(jié)合 NGS 測(cè)序, 單堿基分辨率, 最高性價(jià)比，金標(biāo)準(zhǔn)方案; 富集 CpG 島和啟動(dòng)子區(qū)域等重要區(qū)域，測(cè)序目標(biāo)性強(qiáng)，增加測(cè)序深度;
2. RRBS 可以檢測(cè)高達(dá) 6-9M 以上人基因組 CpG 位點(diǎn); 廣泛適合于人、哺乳動(dòng)物、其他動(dòng)物及魚(yú)類(lèi)的物種;
3. 先進(jìn)的測(cè)序平臺(tái)，采用DNBSEQ-T7測(cè)序平臺(tái)，結(jié)果更可靠
4. 單堿基分辨率，做到甲基化位點(diǎn)的定性和相對(duì)定量分析
技術(shù)流程
圖1 RRBS實(shí)驗(yàn)流程
送樣建議
樣本來(lái)源：人、大鼠和小鼠（其他樣本類(lèi)型請(qǐng)咨詢）
動(dòng)物新鮮冷凍組織樣本1-2g
新鮮或凍存細(xì)胞系樣本≥10^7個(gè)cell
基因組DNA：總量≥ 6ug; 濃度≥ 50ng/ul; 完整性好
備注：不適合 FFPE、cfDNA 等片段化樣本
結(jié)果展示
圖2 甲基化C位點(diǎn)比例分布圖
圖3 染色體水平甲基化分布
(將全基因組按照500kb的長(zhǎng)度劃分成了若干窗口，分別統(tǒng)計(jì)了每個(gè)窗口中的GC含量, gene密度(即基因的數(shù)目), CG甲基化水平, CHG甲基化水平, CHH甲基化水平，用于circos繪制。整個(gè)圖中，除了最外圈染色體核型的標(biāo)簽之外，從外到內(nèi)的5個(gè)heatmap色條，分別表示的是：GC含量(green), gene密度(red), CG甲基化水平(purple), CHG甲基化水平(orange), CHH甲基化水平(light blue)。其中顏色越深表示，密度或者水平越高。)
圖4 DMR在錨定區(qū)域數(shù)量分布比例圖（以CG-DMR為例）
圖5 富集的KEGG通路的散點(diǎn)圖(以比較組Female-vs-Male為例)
(縱軸表示pathway名稱，橫軸表示fold change，點(diǎn)的大小表示此pathway中DMR相關(guān)基因個(gè)數(shù)多少，而點(diǎn)的顏色對(duì)應(yīng)于不同的Qvalue范圍)
案例分析 ：癌前病變到浸潤(rùn)性肺腺癌 DNA 甲基組的演變
Evolution of DNA methylome from precancerous lesions to invasive lung adenocarcinomas[1].
研究方案：在肺腺癌的早期癌變過(guò)程中 DNA 甲基化譜和甲基化腫瘤內(nèi)異質(zhì)性(ITH)的演變尚未得到系統(tǒng)的研究; 本課題通過(guò) RRBS 方案對(duì) 124 個(gè)手術(shù)切除樣本(14 個(gè)非典型腺瘤性增生AAH; 15 個(gè)原位腺癌 AIS; 22 個(gè)微侵襲性腺癌 MIA 和 11 個(gè)侵襲性腺癌 ADC 及病灶旁樣本)進(jìn)行單堿基分辨率的甲基化測(cè)序。
研究結(jié)果：1) 在晚期病變中甲基化變異逐漸增加，甲基化水平明顯升高; 2) 從甲基化變異推斷的系統(tǒng)發(fā)育模式類(lèi)似于基于體細(xì)胞突變的模式，表明 DNA 甲基化和體細(xì)胞突變的演化是平行的; 3) 在晚期疾病中 T 調(diào)節(jié)細(xì)胞與 CD8+T 細(xì)胞的比率較高，這意味著隨著腫瘤進(jìn)展免疫抑 制；4) 全局低甲基化增加與更高的突變負(fù)擔(dān)、拷貝數(shù)變異負(fù)擔(dān)和更高的 Treg/CD8 比率相關(guān)， 表明 DNA 甲基化在肺腺癌早期癌變過(guò)程中對(duì)染色體不穩(wěn)定性、突變和腫瘤免疫微環(huán)境的潛在影響。
圖 6. DNA 甲基化變化隨癌前病變的進(jìn)展而增加
參考文獻(xiàn)：Hu, X., et al., Evolution of DNA methylome from precancerous lesions to invasive lung adenocarcinomas. Nat Commun, 2021. 12(1): p. 687.
